Nadzór immunologiczny jest procesem obronnym organizmu, podczas którego komórki układu odpornościowego rozpoznają i niszczą zarówno komórki nowotworowe jak i zmiany przednowotworowe.
Cechą charakterystyczną rozwijającego się nowotworu jest tworzenie mikrośrodowiska, które oddziałuje immunosupresyjnie na układ odpornościowy, co przyczynia się do ucieczki nowotworu spod nadzoru immunologicznego. W mikrośrodowisku guza znajdują się nie tylko komórki stransformowane, ale także komórki podścieliska, do których zaliczamy również komórki układu immunologicznego. W rezultacie komórki nowotworowe mogą stanowić jedynie 30% bądź nawet mniej wśród wszystkich komórek guza. Wzajemne, dynamiczne interakcje pomiędzy komórkami nowotworowymi a otaczającymi je komórkami podścieliska biorą udział w promocji i progresji nowotworów oraz determinują oporność na stosowane leczenie.
Mieloidalne komórki supresorowe
Mieloidalne komórki supresorowe (MDSC, ang. myeloid-derived suppressor cell) są komórkami układu odpornościowego pochodzenia mieloidalnego, do których zaliczane są niedojrzałe granulocyty, monocyty i komórki dendrytyczne rezydujące w obrębie mikrośrodowiska guza oraz promujące rozwój nowotworu. MDSC reprezentują heterogenną populację komórek mieloidalnych na rozmaitych stadiach różnicowania, cechującą się wysoką plastycznością. Pierwsze doniesienie o hamujących właściwościach komórek mieloidalnych zostało odnotowane ponad 30 lat temu. Wówczas komórki te zostały opisane jako naturalne komórki supresyjne i zostały zdefiniowane jako komórki pozbawione markerów dla linii limfoidalnej. Ich główną cechą charakterystyczną była zdolność do hamowania proliferacji limfocytów po indukcji za pomocą mitogenów i immunogenów, na drodze niezależnej od głównego układu zgodności tkankowej. Obecnie wiadomo, że MDSC wszechstronnie hamują aktywację limfocytów T i B w odpowiedzi na antygeny. Mechanizm blokowania limfocytów wymaga kontaktu pomiędzy komórkami lub odbywa się poprzez rozpuszczalne mediatory uwalnianie do środowiska. U myszy MDSC charakteryzują się ekspresją markerów powierzchniowych takich jak CD11b oraz GR1. Marker GR1 pierwotnie uznawany był jako pojedynczy antygen, gdyż rozpoznawany był z użyciem jednego przeciwciała monoklonalnego. Aktualnie wiadomo, iż składa się on z dwóch odrębnych molekuł: Ly6G i Ly6C. W oparciu o ich ekspresję, MDSC mogą być bardziej szczegółowo rozdzielone na populację granulocytarną (Ly6G+++, Ly6C+) i monocytarną (Ly6G+, Ly6C+++). W stanie zdrowia MDSC są obecne w bardzo małych ilościach, ponieważ ulegają dalszemu różnicowaniu do dojrzałych granulocytów, monocytów oraz komórek dendrytycznych. Jednakże, ich liczba zdecydowanie wzrasta w stanach patologicznych, takich jak: choroby nowotworowe, autoimmunizacyjne czy infekcje. Dzieje się tak pod wpływem cytokin, które stymulują proliferację MDSC, oraz w wyniku zahamowania ich różnicowania. W konsekwencji MDSC ulegają nagromadzeniu w obrębie mikrośrodowiska guza oraz we wtórnych narządach limfatycznych, gdzie przyczyniają się do hamowania aktywności limfocytów T. Immunosupresyjne działanie MDSC wynika głównie z wytwarzania cytokin wpływających hamująco na komórki układu immunologicznego (IL-10, TGF-β) oraz enzymów regulujących stężenie L-argininy: arginazy (ARG) i indukowalnej syntazy tlenku azotu (iNOS). W przebiegu metabolizmu L-argininy, jak i wskutek aktywacji oksydazy NADPH, następuje wytwarzanie reaktywnych form tlenu i azotu, które jeszcze bardziej wzmagają uogólniony efekt immunosupresyjny.
L-arginina
L-arginina jest aminokwasem egzogennym dla niemowląt, natomiast względnie egzogennym dla dorosłych, co oznacza, że w warunkach zwiększonego zapotrzebowania, takich jak zapalenie, ciąża, uraz i choroba nowotworowa, musi być dostarczana w diecie. L-arginina bierze udział w licznych, kluczowych procesach w organizmie. Po pierwsze, uczestniczy w metabolizmie azotu poprzez udział w cyklu mocznikowym zachodzącym w wątrobie. Po drugie, jest niezbędna do syntezy kreatyniny, która zaopatruje tkanki o dużym zapotrzebowaniu na energię, takie jak mózg i mięśnie. Po trzecie, i najważniejsze w aspekcie wpływu L-argininy na funkcję układu odpornościowego, L-arginina jest niezbędna do proliferacji limfocytów T, a tym samym do zainicjowania efektywnej odpowiedzi przeciwnowotworowej.
Arginazy
Arginazy (ARGs) są enzymami, które katalizują reakcję hydrolizy L-argininy do L-ornityny i mocznika. ARGs są enzymami silnie konserwowanymi w toku ewolucji. Wyróżniamy dwa izoenzymy: arginazę-1 (ARG-1) oraz arginazę-2 (ARG-2), które różnią się lokalizacją w komórce. ARG-1 jest enzymem cytoplazmatycznym, podczas gdy ARG-2 znajduje się w mitochondriach. Oba enzymy katalizują tę samą reakcję biochemiczną. Duża aktywność ARG jest często obserwowana u chorych z nowotworami, zarówno z guzami litymi jak i z nowotworami układu krwiotwórczego. Zwiększona aktywność ARG została stwierdzona we krwi, w mikrośrodowisku guza i/lub we wtórnych narządach limfatycznych. Wytwarzanie ARG w tych miejscach przypisywane jest głównie opisanym wyżej komórkom MDSC, jak również populacji makrofagów związanych z nowotworami (TAM, ang. tumor-associated macrophages). Transport pozakomórkowej L-argininy do wnętrza komórki odbywa się za pomocą specjalnych transporterów dla aminokwasów kationowych (CAT, ang. cationic amino-acid transporters). Transportery te zakotwiczone są w błonie komórkowej i dostarczają substratu do degradacji przez ARG w wewnętrznych kompartmentach komórki. Obecność licznych transporterów CAT została także potwierdzona na powierzchni komórek MDSC, co potwierdza rolę tych komórek w obniżaniu stężenia L-argininy niezbędnej do prawidłowego funkcjonowania limfocytów T.
Uszczuplenie zasobów L-argininy poprzez wysoką ekspresję ARG jest bardzo silnym mechanizmem immunosupresyjnym. Brak L-argininy w środowisku blokuje proliferację limfocytów T oraz prowadzi do obniżenia ekspresji łańcucha ζ stanowiącego kluczowy element kompleksu receptora limfocytu T (TCR, ang. T cell receptor), który bierze udział w przekazywaniu sygnału i aktywacji tych komórek. Ponadto, zmniejszenie stężenia L-argininy w środowisku prowadzi do zahamowania cyklu komórkowego limfocytów T. Proponowany mechanizm tego zjawiska skupia się na szlaku przekazywania sygnałów przez kinazę GCN2 (ang. general control non-depressible 2 kinase). Deficyt aminokwasów, m. in. L-argininy, powoduje aktywację kinazy GCN2 i następnie fosforylację eukariotycznego czynnika inicjacji translacji 2 (EIF2α, ang. eukaryotic initiation factor 2). Białko EIF2α bierze udział w inicjacji translacji białek w komórkach a jego fosforylacja prowadzi do zahamowania biosyntezy białek w komórce. Ograniczenie namnażania limfocytów cytotoksycznych skutkuje mniej efektywnym niszczeniem komórek nowotworowych i przyczynia się do promowania wzrostu nowotworu. Dodatkowo limfocyty T pozbawione L-argininy wytwarzają mniejsze ilości interferonu gamma (IFN-γ), który jest kluczowym mediatorem odpowiedzi przeciwnowotworowej. Omówione mechanizmy immunosupresyjne związane z obecnością ARG zostały przedstawione na rycinie 1.
Rycina 1. Mechanizm hamowania funkcji limfocytów T przez MDSC z uwzględnieniem metabolizmu L-argininy.Wysoka aktywność arginazy (ARG) i związany z nią spadek L-argininy w mikrośrodowisku nowotworu powoduje zablokowanie proliferacji limfocytów T poprzez zaburzenie szlaku GCN2 oraz zablokowanie aktywacji limfocytów T w wyniku spadku ekspresji łańcucha CD3𝜁 w TCR. Aktywność iNOS prowadzi do powstawania NO, który nitrozyluje reszty cysteinowe, co uszkadza szlak przekazywania sygnału indukowany IL-2. Ponadto, NO prowadzi do powstania nadtlenoazotynu (ONOO−), który powoduje nitrację tyrozyn w TCR i zaburza przekazywanie sygnałów w limfocytach T. ARG: arginaza; CAT2B: transporter aminokwasów kationowych (ang. cationic amino acid transporter 2); EIF2α: eukariotyczny czynnik inicjacji translacji 2 (ang. eukaryotic translation initiation factor 2α); GCN2: kinaza GCN2 (ang. general control non-depressible 2 kinase); IL: interleukina; IL-2R: receptor dla IL-2; iNOS: indukowalna syntaza tlenku azotu (ang. inducible nitric oxide synthase); MDSC: mieloidalne komórki supresorowe (ang. myeloid derived suppressor cells); NO: tlenek azotu (ang. nitric oxide); RNOS: reaktywne formy azotu (ang. reactive nitrogen-oxide species); TCR: receptor limfocytu T (ang. T-cell receptor).
Syntazy tlenku azotu
Oprócz arginaz, L-arginina jest także substratem dla rodziny enzymów określanych jako syntazy tlenku azotu (NOS, ang. nitric oxide synthases). Dotychczas opisano trzy izoformy, które różnią się rozmieszczeniem pomiędzy tkankami i w komórce. W komórkach układu odpornościowego, w tym w komórkach linii mieloidalnej, najczęściej występuje indukowalna forma NOS – iNOS, określana także jako NOS2. Inna izoforma - NOS1 występuje w neuronach, a NOS3 zlokalizowana jest w komórkach śródbłonka. NOS katalizuje reakcję przemiany L-argininy w L-cytrulinę i tlenek azotu (NO, ang. nitric oxide). W tym miejscu warto zwrócić uwagę na podwójną rolę tlenku azotu. Przede wszystkim, NO jest istotnym czynnikiem obronnym, wytwarzanym w infekcjach bakteryjnych i pasożytniczych. Jednakże, NO wytwarzany w mikrośrodowisku guza może w wielkoraki sposób modulować odpowiedź przeciwnowotworową i rozwój guza. Po pierwsze, NO poprzez nitrozylację i nitrację aminokwasów powoduje zahamowanie przekazywania sygnałów przez TCR i zmniejsza odpowiedź z udziałem IL-2, co wpływa negatywnie na działanie limfocytów T. Po drugie, wysokie stężenia NO mogą wywołać bezpośredni efekt proapoptotyczny w stosunku do limfocytów T. Ponadto, NO przyczynia się do angiogenezy, czyli procesu, w którym powstają nowe naczynia krwionośne zapewniające dostawę tlenu i substancji odżywczych do wnętrza skupiska komórek nowotworowych i umożliwiają wzrost guza. Mechanizmy immunosupresyjne z udziałem NOS zostały zilustrowane na rycinie 1.
Synergizm ARG i iNOS w immunosupresji
ARG i iNOS posiadają wspólny substrat – L-argininę, dlatego ich aktywność musi być zrównoważona. Zwiększona aktywność ARG negatywnie reguluje enzymatyczną aktywność iNOS poprzez zmniejszenie dostępności L-argininy. W sytuacji, w której oba enzymy byłyby zaktywowane na takim samym poziomie, należałoby rozważyć profil kinetyczny obydwu reakcji. iNOS ma znacznie większe powinowactwo do substratu, natomiast katalizuje reakcje zdecydowanie wolniej. Z tych względów L-arginina może być przekształcana w podobnym tempie przez oba enzymy. ARG funkcjonuje jako regulator wytwarzania NO i dlatego ma wpływ na wytwarzanie reaktywnych form tlenu i azotu. Ekspresja obu enzymów jest także kontrolowana poprzez cytokiny wytwarzane przez limfocyty T pomocnicze (Th, ang. T helper lymphocytes). Cytokiny wytwarzane przez subpopulację Th1, takie jak IFN-γ i TNF-α, indukują ekspresję genu dla iNOS, ale hamują ARG1, natomiast cytokiny wytwarzane przez subpopulację Th2, do których należą IL-4, IL-10 i IL-13, wywierają przeciwne działanie. Zrównoważona ekspresja genów dla obydwu enzymów rozkładających L-argininę odgrywa kluczową rolę w utrzymywaniu prawidłowego funkcjonowania komórek w organizmie. Ekspresja genów dla iNOS i ARG jest charakterystyczną cechą komórek MDSC, determinującą ich właściwości immunosupresyjne. Metabolizm L-argininy i jego regulacja przez cytokiny limfocytów pomocniczych zostały przedstawione na rycinie 2.
Rycina 2. Metabolizm L-argininy (opis w tekście). ARG1: arginaza-1; IFN-γ: interferon gamma; IL: interleukina; iNOS: indukowalna syntaza tlenku azotu (ang. inducible nitric oxide synthase); NO: tlenek azotu (ang. nitric oxide); RNOS: reaktywne formy azotu (ang. reactive nitrogen-oxide species); ROS: reaktywne formy tlenu (ang. reactive oxygen species); TNF-α: czynnik martwicy nowotworu (ang. tumor necrosis factor).
Strategie terapeutyczne
L-arginina jest newralgicznym aminokwasem w obrębie rozwijającego się nowotworu, ponieważ jej stężenie wpływa na namnażanie zarówno komórek nowotworowych jak i komórek układu odpornościowego. W związku z tym, L-arginina może być uznawana za składnik odżywczy zarówno dla nowotworu jak i komórek, które powinny go zwalczać. W kontekście terapeutycznym obydwa podejścia, zarówno wzrost jak i obniżenie aktywności L-argininy podlegają obecnie intensywnym badaniom naukowym.
ARG wytwarzana przez MDSC stanowi atrakcyjny cel terapeutyczny w leczeniu onkologicznym dlatego, że jej zablokowanie mogłoby zwiększyć skuteczność przeciwnowotworowej odpowiedzi inicjowanej przez komórki układu immunologicznego. Obecnie prowadzone jest jedno badanie kliniczne oceniające skuteczność bispecyficznego inhibitora ARG1 i ARG2 u chorych z guzami litymi w zaawansowanym stadium. Badana jest skuteczność przeciwnowotworowa inhibitora ARGs w monoterapii oraz w połączeniu z inhibitorem punktu kontrolnego odpowiedzi immunologicznej – przeciwciałem anty-PD-1. Przeciwciało anty-PD-1 blokuje sygnał hamujący aktywację limfocytów T i w ten sposób przywraca przeciwnowotworową odpowiedź immunologiczną. Alternatywną metodą polegającą na zwiększeniu podaży L-argininy jest suplementacja L-argininy. Strategia ta jest obecnie testowana w dwóch badaniach klinicznych u chorych z nowotworami w okresie okołooperacyjnym.
Odmienną strategią przeciwnowotworową jest blokowane wzrostu guza poprzez obniżenie stężenia L-argininy. Jednym z obecnie testowanych w badaniach klinicznych sposobów jest zastosowanie ludzkich rekombionowanych ARG. Najczęściej stosowana jest forma PEGylowana, jako że dołączenie cząsteczki glikolu polietylowanego znacznie zwiększa biodostępność i redukuje immunogenność enzymów. Ten typ terapii ma zastosowanie głównie w wypadku tzw. guzów zależnych od argininy (ang. arginine auxotrophic tumors), które mają obniżone stężenie i aktywność kluczowych enzymów odpowiadających za wewnątrzkomórkowy recykling i syntezę L-argininy: syntetazę argininobursztynianową (ASS-1) i transkarbamylazę ornitynową. Do nowotworów zależnych od podaży argininy zaliczamy m. in. raka wątrobowokomórkowego, czerniaka złośliwego, raka gruczołu krokowego i nerki. Celowanie w eliminację L-argininy w wypadku nowotworu wykazującego brak ASS-1 powoduje apoptozę komórek guza. Jednakże, skutkiem ubocznym podejścia terapeutycznego, w którym zmniejsza się stężenie L-argininy, jest ryzyko zablokowania przeciwnowotworowego działania układu odpornościowego.
Dodatkowo, kilka innych schematów leczenia nowotworu ukierunkowanych na populację MDSC jest obecnie w fazie eksperymentalnej. Strategie te skupiają się na: 1) dezaktywacji funkcji MDCS, 2) różnicowaniu MDSC w dojrzałe komórki mieloidalne, 3) blokowaniu powstawania MDSC oraz 4) zmniejszaniu liczby MDSC. Podsumowując przedstawiony stan wiedzy o metabolizmie L-argininy, istnieje bardzo wąska granica pomiędzy zapotrzebowaniem na L-argininę przez komórki nowotworu oraz komórki układu odpornościowego. Aby dobrać najskuteczniejszą strategię do określonego typu nowotworu, niezbędne są dalsze badania. Z całą pewnością, projektując badania w tym zakresie, naukowcy powinni zawsze mieć na uwadze podwójną rolę L-argininy w mikrośrodowisku nowotworu.
Linki do przydatnych artykułów:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22437938
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25949858
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27861915
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26913960
Strona poświęcona badaniom klinicznym:
https://clinicaltrials.gov/ (NCT02903914, NCT02285101, NCT02987296)
Autorzy: mgr Anna Sosnowska, dr Małgorzata Firczuk, prof. Jakub Gołąb