Arrow
Arrow
Slider

Limfocyty T regulatorowe i ich blokowanie w terapii przeciwnowotworowej

Limfocyty T regulatorowe – charakterystyka ogólna

                Główną funkcją układu odpornościowego jest ochrona organizmu przed różnorodnymi patogenami, takimi jak bakterie, grzyby czy wirusy. Jest to możliwe dzięki jego zdolności do odróżniania tego, co dla organizmu jest „swoje” od tego, co „obce” i potencjalnie szkodliwe oraz usuwania “obcego” w procesie zwanym odpowiedzią immunologiczną. Czynność układu odpornościowego podlega bardzo precyzyjnej i wydajnej regulacji, mającej na celu z jednej strony zapewnienie tolerancji wobec własnych tkanek, a z drugiej usunięcie zagrożenia wynikającego z przedostania się do organizmu szkodliwych patogenów. Ważną rolę w tej regulacji odgrywają między innymi różne subpopulacje limfocytów T CD4+, które w większości pełnią funkcje limfocytów T pomocniczych (Th, ang. helper T cells), wspomagających rozwój odpowiedzi immunologicznej. Wyjątkiem są limfocyty T CD4+ regulatorowe (Treg, ang. regulatory T cells), które hamują odpowiedź immunologiczną i stanowią jeden z kluczowych mechanizmów zabezpieczających przed autoagresją.

                Limfocyty Treg charakteryzują się stałą obecnością stosunkowo dużej liczby cząsteczek białka powierzchniowego CD25 (łańcuch α receptora interleukiny 2, IL-2Rα) oraz czynnika transkrypcyjnego FoxP3 (ang. forkhead box protein P3), kodowanego przez gen znajdujący się w chromosomie X. Obecność obydwu tych białek jest niezbędna do dzielenia się, różnicowania oraz immunomodulujących funkcji komórek Treg. Mutacje w genie FoxP3 u ludzi powodują zespół zaburzenia odporności, poliendokrynopatii i enteropatii sprzężony z chromosomem X (IPEX, ang. immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, and X-linked syndrome). Warto dodać, iż ilość cząsteczek CD25 i FoxP3 wzrasta przejściowo również w innych subpopulacjach limfocytów T w wyniku ich aktywacji, jednak w tym wypadku jest znacznie niższa w porównaniu ze stałą, dużą ilością cząsteczek tych białek w komórkach Treg.

                Innymi białkami charakterystycznymi dla limfocytów Treg są: CTLA-4 (ang. cytotoxic T lymphocyte antigen 4), ICOS (ang. inducible T cell co-stimulator) oraz GITR (ang. glucocorticoid-induced TNF receptor). Poza tym, komórki Treg cechuje brak lub stosunkowo niewielka ilość cząsteczek  CD127 (podjednostki α receptora interleukiny 7, IL-7Rα), czym różnią się od pozostałych subpopulacji limfocytów T CD4+.

                Ze względu na fakt, iż limfocyty Treg stanowią jeden z najważniejszych mechanizmów hamujących odpowiedź immunologiczną, odgrywają one rolę w wielu procesach patologicznych i fizjologicznych zachodzących w organizmie człowieka, takich jak autoagresja, przewlekłe infekcje, alergia, oddziaływanie z florą bakteryjną, przeszczepianie narządów, tolerancja matczyno-płodowa, a także odpowiedź przeciwnowotworowa.  

 

Subpopulacje limfocytów T regulatorowych

                Ze względu na miejsce powstawania i różnicowania, można wyróżnić dwie subpopulacje limfocytów Treg: grasicze (naturalne) limfocyty Treg (tTreg, od ang. thymus), które powstają w grasicy, gdzie zachodzi proces dojrzewania limfocytów T, oraz obwodowe (indukowane) limfocyty Treg (pTreg, od ang. peripheral), powstające poza grasicą, zwłaszcza w błonach śluzowych, z limfocytów T CD4+.

                W procesie dojrzewania limfocytów T w grasicy, na powierzchni tymocytów (dojrzewających limfocytów T) pojawiają się m.in. receptory limfocytów T (TCR, ang. T cell receptor). Funkcją tych receptorów jest rozpoznanie fragmentów obcych białek (antygenów), prezentowanych przez cząsteczki należące do głównego układu zgodności tkankowej (MHC, ang. major histocompatibility complex), w celu zaindukowania odpowiedzi immunologicznej. Receptory TCR, specyficzne dla różnorodnych antygenów, formowane są w procesie losowej rearanżacji genów. Jednak znaczna część powstających w wyniku tego procesu receptorów TCR jest zbudowana nieprawidłowo. Z tego względu dojrzewające limfocyty T poddawane są tzw. selekcji pozytywnej, mającej na celu wyłonienie komórek z poprawnie zbudowanym receptorem TCR, czyli takim, który potrafi rozpoznać cząsteczki MHC prezentujące własne antygeny (autoantygeny) z niskim powinowactwem. Związanie kompleksu MHC-antygen stanowi dla danego limfocytu sygnał do przeżycia. Pozostałe komórki, czyli takie, które nie rozpoznają żadnego antygenu, przechodzą proces redagowania receptora lub ulegają apoptozie (tzw. „śmierci z zaniedbania”). W kolejnym etapie procesu dojrzewania, tymocyty przechodzą tzw. selekcję negatywną, w wyniku której usuwane są takie komórki, które rozpoznają autoantygeny ze zbyt dużym powinowactwem. Selekcja negatywna ma zatem na celu zapewnienie tolerancji wobec własnych tkanek organizmu. Co ważne, część tymocytów, które rozpoznają własne antygeny z dużym powinowactwem, przechodzi selekcję negatywną i staje się subpopulacją grasiczych limfocytów Treg. W pewnym uproszczeniu przyjmuje się, że komórki Treg powstające w grasicy odpowiadają przede wszystkim za tolerancję względem autoantygenów. Natomiast obwodowe komórki Treg działają głównie w skórze i jelitach, gdzie hamują odpowiedź układu odpornościowego skierowaną przeciwko obcym antygenom, pochodzącym np. z niegroźnych dla organizmu mikroorganizmów flory jelitowej, czy antygenów pokarmowych. Co ciekawe, komórki Treg indukowane na obwodzie wykazują znaczną plastyczność i w czasie infekcji są zdolne do przekształcenia się w efektorowe limfocyty T (Th1 lub Th17) i promowania procesu zapalnego. Zależy to od rodzaju i ilości cytokin w otoczeniu.

                 W początkowym etapie swoistej odpowiedzi immunologicznej, komórki prezentujące antygen aktywują dziewicze limfocyty T (ang. naïve T cells), prezentując im antygeny oraz dostarczając dodatkowe sygnały kostymulujące. Zaktywowane limfocyty T ulegają intensywnym podziałom i tworzą funkcjonalnie zróżnicowane subpopulacje: limfocytów T efektorowych oraz limfocytów T pamięci. Efektorowe limfocyty T to krótko żyjące komórki, które migrują do miejsca zakażenia, gdzie unieszkodliwiają obecne tam patogeny, a następnie, po wykonaniu tego zadania, umierają w wyniku apoptozy. Z kolei limfocyty T pamięci żyją bardzo długo po zakończeniu infekcji. Komórki te zasiedlają obwodowe narządy limfatyczne (centralne limfocyty T pamięci) lub inne tkanki (efektorowe limfocyty T pamięci). W sytuacji ponownego pojawienia się w organizmie tego samego antygenu, dochodzi do wtórnej reakcji immunologicznej, w czasie której limfocyty T pamięci wykazują wzmożoną aktywność – dzielą się i eliminują patogeny znacznie szybciej i intensywniej niż pierwotnie. Podobnie do cytotoksycznych i pomocniczych limfocytów T, również wśród komórek Treg można wskazać subpopulacje różniące się poziomem zróżnicowania i funkcją. Wyróżnia się limfocyty Treg dziewicze i limfocyty Treg efektorowe, które można rozróżnić na podstawie ilości cząsteczek FoxP3, CD25 i CD45RA oraz limfocyty Treg pamięci, dla których określenie charakterystycznych markerów wciąż stanowi wyzwanie. Wybrane cechy różnych subpopulacji limfocytów Treg przedstawione są w Tabeli 1.

Tabela 1. Charakterystyka poszczególnych stopni zróżnicowania komórek Treg u człowieka.

.tabelaPL

 

Mechanizmy immunosupresji zależne od limfocytów T regulatorowych

                Limfocyty Treg mają zdolność do hamowania aktywności i funkcji innych leukocytów: konwencjonalnych (cytotoksycznych i pomocniczych) limfocytów T, limfocytów B, komórek NK, komórek dendrytycznych czy makrofagów, działając poprzez różne, uzupełniające się mechanizmy i wykorzystując wiele różnych cząsteczek.

                Czynnik transkrypcyjny FoxP3 reguluje ekspresję genów ważnych dla przeżycia i prawidłowego funkcjonowania limfocytów Treg, takich jak IL-2, CD25 oraz innych podjednostek receptora IL-2: CD122 (łańcuch β) i CD132 (łańcuch γ), a także CTLA-4. Co ciekawe, z jednej strony FoxP3 odpowiada za zwiększoną ilość podjednostek receptora IL-2, z drugiej zmniejsza wytwarzanie tej interleukiny. W związku z tym, komórki Treg są zależne od IL-2 wydzielanej przez inne komórki, m.in. przez aktywowane, konwencjonalne limfocyty T. Wychwytując IL-2 z otoczenia, komórki Treg ograniczają dostępność tej cytokiny dla innych subpopulacji limfocytów T, co w konsekwencji prowadzi do zahamowania podziałów i aktywności tych komórek. FoxP3 jest odpowiedzialny także za zwiększoną ilość cząsteczek białek CTLA-4 oraz ICOS. CTLA-4 wiąże się z cząsteczkami kostymulujacymi CD80/CD86 występującymi na powierzchni komórek prezentujących antygen (np. komórek dendrytycznych), ze znacznie większym powinowactwem niż CD28, będący ligandem dla CD80/CD86 na limfocytach T. W ten sposób CTLA-4 hamuje sygnał kostymulujący niezbędny do pełnej aktywacji limfocytów T. Co więcej, CTLA-4 powoduje również zmniejszenie ilości cząsteczek CD80/CD86 na komórkach dendrytycznych. Innym mechanizmem hamującym odpowiedź immunologiczną jest wydzielanie przez komórki Treg immunosupresyjnych cytokin, takich jak interleukina 10 (IL-10), interleukina 35 (IL-35), czy transformujący czynnik wzrostu β (TGF-β, ang. transforming growth factor β). Warto wspomnieć także o innym mechanizmie regulacji odpowiedzi immunologicznej przez komórki Treg, związanym z dużą ilością cząsteczek CD39 oraz CD73 na powierzchni tych komórek. Wymienione białka to enzymy, które katalizują reakcję hydrolizy ATP do AMP, a następnie do adenozyny, która hamuje aktywność limfocytów T i B, komórek dendrytycznych oraz makrofagów, działając poprzez receptory A2A obecne na powierzchni tych komórek. Wymienione mechanizmy zostały przedstawione schematycznie na rycinie 1.

0001 2 

Rycina 1. Schemat obrazujący mechanizmy wykorzystywane przez limfocyty Treg do hamowania odpowiedzi immunologicznej. Rozmiar komórek Treg jest taki sam jak innych limfocytów T, tutaj komórki Treg zostały kilkukrotnie powiększone w celu zachowania przejrzystości ryciny. 

Limfocyty T regulatorowe a nowotwory

                Jednym z najważniejszych czynników, które wpływają na wzrost i rozwój nowotworu jest jego otoczenie, czyli tzw. mikrośrodowisko nowotworu (TME, ang. tumor microenvironment). Oprócz komórek nowotworowych w skład TME wchodzą naczynia krwionośne guza, komórki układu odpornościowego, fibroblasty, rozpuszczalne cząsteczki sygnałowe oraz składniki macierzy zewnątrzkomórkowej. Co ważne, komórki nowotworowe mają zdolność do modyfikowania TME, poprzez wydzielanie cytokin o charakterze czynników wzrostu, jak np. czynnik wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF, ang. vascular endothelial growth factor) i chemokin wspomagających proces angiogenezy oraz nasilających napływ komórek o właściwościach immunosupresyjnych, m.in. limfocytów Treg. Liczne badania dotyczące wielu typów nowotworów, prowadzone zarówno u myszy, jak i u ludzi, wykazały zwiększoną liczbę komórek Treg w tkankach zmienionych nowotworowo w porównaniu z tkankami prawidłowymi. Limfocyty Treg związane z nowotworami mają najczęściej fenotyp komórek Treg efektorowych (FoxP3wysokie, CD25wysokie, CD45RA-), charakteryzują się zwiększoną ilością wielu cząsteczek białek powierzchniowych (CTLA-4, ICOS, CCR4, PD-1 i CD69) oraz wykazują wzmożoną aktywność immunosupresyjną. Komórki te aktywnie hamują efektorowe limfocyty T rozpoznające antygeny nowotworowe i w ten sposób ułatwiają dalszy wzrost nowotworu. Z drugiej strony, w niektórych typach nowotworów wykazano, że limfocyty Treg efektorowe, poprzez wydzielanie IL-10 i zdolności do zahamowania limfocytów Th17, które produkują cytokiny prozapalne (głównie IL-17 i IL-22), mogą tłumić zapalenie i przez to ograniczać rozwój nowotworu. Przykładowo, w grupie chorych cierpiących na raka jelita grubego, u których stwierdzono zwiększony stosunek limfocytów Treg względem Th17, zaobserwowano mniejszą zdolność do tworzenia przerzutów, co z kolei wiązało się z bardziej optymistyczną prognozą dotyczącą czasu życia tych chorych.

                Warto także dodać, iż funkcje limfocytów Treg mogą być modulowane przez inne komórki układu odpornościowego, znajdujące się w TME. U chorych z rakiem jelita grubego wykazano na przykład, że komórki tuczne mogą pobudzać limfocyty Treg do wydzielania IL-17, zamiast IL-10. Takie komórki Treg wydzielające IL-17 „dolewają oliwy do ogniska zapalenia” w TME i w ten sposób stają się sprzymierzeńcami rozwijającego się nowotworu.

Limfocyty T regulatorowe jako cel terapii nowotworów

                Nagromadzenie limfocytów Treg w obrębie mikrośrodowiska nowotworu, z wyjątkiem tych rodzajów raka, których rozwój uzależniony jest od przewlekłego zapalenia, zwykle uznaje się za czynnik sprzyjający progresji choroby i wiąże się ze słabym rokowaniem dla chorych.  Dlatego też, komórki Treg stały się atrakcyjnym celem wielu potencjalnych, ciągle testowanych terapii nowotworów, takich jak:

  • nieswoista eliminacja limfocytów Treg przez chemioterapeutyki – cyklofosfamid (w małych dawkach) i inne leki stosowane w chemioterapii powodują redukcję liczby komórek Treg poprzez zahamowanie ich podziałów i indukcję apoptozy, a także poprzez zaburzenie ich funkcji w wyniku obniżenia ilości cząsteczek białek FoxP3 i GITR;
  • usuwanie limfocytów Treg – na przykład przy użyciu przeciwciał skierowanych przeciwko cząsteczkom CD25 (daklizumab, basiliksumab lub LMB-2);
  • zahamowanie wnikania limfocytów Treg do mikrośrodowiska nowotworu – poprzez zablokowanie oddziaływania pomiędzy chemokiną a receptorem dla tej chemokiny, np. CCL22-CCR4, które w wielu nowotworach uważa się za jeden z kluczowych mechanizmów prowadzących do nagromadzenia komórek Treg w obrębie TME;
  • zablokowanie inhibitorów punktów kontrolnych – za pomocą przeciwciał przeciwko CTLA-4 (ipilimumab,  tremelimumab), co może wywołać usunięcie Treg z TME oraz doprowadzić do aktywacji układu odpornościowego i zahamowania progresji choroby;
  • zablokowanie sygnałów przekazywanych przez receptory nadrodziny czynnika martwicy nowotworów (TNFα, ang. tumor necrosis factor α) – poprzez zastosowanie przeciwciał - antagonistów (nie powodujących usuwania komórek Treg) swoistych dla wybranych receptorów z rodziny TNFR, obecnych na limfocytach Treg (np. przeciwciała anty-GITR lub anty-OX40);
  • zahamowanie aktywności 2,3-dioksygenazy indoloaminy (IDO), enzymu katalizującego reakcję przekształcania tryptofanu do kinureniny, co wywołuje różnicowanie limfocytów T konwencjonalnych do limfocytów Treg; różne inhibitory IDO (indoksymod, nawoksymod, epakadostad i inne) są obecnie intensywnie testowane w kombinacji z innymi terapiami nowotworów; co ciekawe, w mysim modelu czerniaka wykazano, iż użycie inhibitorów IDO w połączeniu ze szczepionkami przeciwnowotworowymi skutkuje przekształceniem limfocytów Treg w limfocyty Th17 oraz wzrostem aktywności limfocytów T i ich wydajności w zwalczaniu komórek nowotworowych.

Wykorzystanie limfocytów T regulatorowych w leczeniu chorób autoimmunizacyjnych

Trwają także intensywne badania nad różnymi potencjalnymi terapiami opartymi na wykorzystaniu limfocytów Treg w transplantologii oraz w leczeniu chorób autoimmunizacyjnych, gdzie regulatorowa funkcja komórek Treg jest zaburzona lub niewystarczająca do zahamowania nadmiernej odpowiedzi immunologicznej. Jedną z najbardziej obiecujących strategii, obecnie testowanych w badaniach klinicznych, mających na celu zwiększenie liczby komórek Treg, jest tzw. adoptywny transfer komórek Treg namnożonych ex vivo. Metoda ta polega na wyizolowaniu komórek Treg z krwi pobranej od pacjenta lub zdrowego dawcy za pomocą odpowiednich markerów swoistych dla tych komórek (np. CD25, brak CD127), a następnie namnożeniu, zaktywowaniu i podaniu chorym. Alternatywnie, podaje się limfocyty Treg generowane ex vivo z dziewiczych limfocytów T CD4+. Pomimo ogromnego postępu i obiecujących wyników badań klinicznych testujących adoptywny transfer komórek Treg, wciąż pozostaje wiele wyzwań, np. opracowanie lepszej metody oczyszczania komórek Treg z krwi (w celu uniknięcia zanieczyszczeń konwencjonalnymi limfocytami T, u których, po aktywacji, również obserwuje się zwiększoną ilość cząsteczek FoxP3 i CD25), jak również poprawę stabilności tych komórek, zwłaszcza po ich podaniu choremu.

Podsumowanie

Obecnie testowanych jest wiele różnych klinicznych strategii mających za zadanie z jednej strony pobudzić funkcje komórek Treg w celu wykorzystania ich w transplantologii oraz w zwalczaniu chorób autoimmunizacyjnych, a z drugiej wyeliminować lub zahamować u pacjentów onkologicznych. Aby lepiej zrozumieć biologię limfocytów Treg i dzięki temu opracować mniej toksyczne i bardziej skuteczne terapie z wykorzystaniem tych komórek, niezbędne są jednak dalsze badania podstawowe i translacyjne.  

 

Bibliografia

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27590281

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28983402

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27995907

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28757603

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30310234

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5113825

https://www.youtube.com/watch?v=cvo63_7Xc0I

Autorzy: dr Agnieszka Góral, dr Angelika Muchowicz, prof. Jakub Golab, dr hab. Radosław Zagożdżon, dr Małgorzata Firczuk

OPEN